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Sep 25, 2023

家畜豚における OprI と融合した組換えアフリカ豚コレラウイルス抗原のカクテルによって誘発される体液性および細胞性免疫応答の評価

Giornale di virologia

Virology Journal volume 20、記事番号: 104 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アフリカ豚コレラ（ASF）は、ASF ウイルス（ASFV）によって引き起こされる家畜豚の致死率の高い病気ですが、現在、市販のワクチンはありません。 ASFV のゲノムは 150 を超えるタンパク質をコードしており、その一部はサブユニット ワクチンに含まれていますが、ASFV 感染に対する防御は限られています。

ASFVタンパク質によって誘導される免疫応答を強化するために、細菌リポタンパク質OprI、2つの異なるASFVタンパク質/エピトープ、およびユニバーサルCD4+ T細胞エピトープからなる3つの融合タンパク質、すなわちOprI-p30修飾p54-TT、OprI-を発現および精製しました。 p72 エピトープ切断型 pE248R-TT、および OprI 切断型 CD2v 切断型 pEP153R-TT。 これらの組換えタンパク質の免疫刺激活性は、最初に樹状細胞で評価されました。 次に、ISA206 アジュバントを配合したこれら 3 つの OprI 融合タンパク質カクテル (O-Ags-T 配合物) によって誘導される体液性および細胞性免疫をブタで評価しました。

OprI 融合タンパク質は、炎症誘発性サイトカインの分泌を増加させて樹状細胞を活性化しました。 さらに、O-Ags-T 製剤は、インビトロで刺激した後、高レベルの抗原特異的 IgG 応答とインターフェロン-γ 分泌 CD4+ および CD8+ T 細胞を誘発しました。 重要なことに、O-Ags-T製剤でワクチン接種されたブタからの血清および末梢血単核細胞は、in vitroでのASFV感染をそれぞれ82.8%および92.6%減少させた。

我々の結果は、ISA206アジュバントと配合されたOprI融合タンパク質カクテルが、ブタにおいて強力なASFV特異的体液性および細胞性免疫応答を誘導することを示唆している。 私たちの研究は、ASFに対するサブユニットワクチンのさらなる開発に貴重な情報を提供します。

アフリカ豚コレラ (ASF) は、伝染性の高い出血性かつ壊滅的な豚ウイルス性疾患であり、世界中で深刻な経済的損失を引き起こしますが、有効なワクチンはありません [1]。 ASF の原因物質である ASF ウイルス (ASFV) は、アスファウイルス科のアスフィウイルス属に属する大型のエンベロープ DNA ウイルスです [2]。 ASFV ゲノムの長さは約 170 ～ 193 kbp の間で変化し、150 を超えるオープン リーディング フレームをコードします [3]。 B646L 遺伝子 (キャプシドタンパク質 p72 をコードする) の配列に応じて、ASFV は現在 24 の異なる遺伝子型に分類されています [4]。 ASF はケニアで最初に報告され、長年にわたってサハラ以南のアフリカで風土病となってきました [5]。 2007 年にジョージアに導入され、それ以来東ヨーロッパの多くの国に広まりました [6]。 2018 年に ASF が中国で発生し、国内の多くの地域および他のアジア諸国に急速に広がりました [7]。 何百万頭もの豚がASFによって殺されたり、この病気を抑制しようとして殺処分されたりしています。 現在、ASF は依然として中国で蔓延しており、養豚産業にとって深刻な脅威であり続けています [8]。 したがって、ASFに対する安全で効果的なワクチンが緊急に必要とされています。

ASF に対するワクチンの開発のために、さまざまなアプローチが評価されています [9]。 しかし、ASFに対する安全で効果的なワクチンを開発する試みはすべて失敗に終わりました[9]。 不活化ウイルスを含むワクチンはこれまでのところ防御効果を与えていません[10]。 弱毒性または低毒性の ASFV 株は、ブタにおいて毒性の高い ASFV 株に対する防御免疫反応を誘発することが実証されています [11、12、13、14]。しかし、ワクチン接種されたブタは通常、慢性ウイルス血症などの有害な副作用を経験します [15]。 さらに、生きた弱毒化ＡＳＦＶの適用は、安全性について重大な懸念を引き起こす。 対照的に、ASFV攻撃に対する防御は部分的にしか誘導されないにもかかわらず、ASFVサブユニットワクチンはより安全な選択肢を提供する[16]。 組換えp30とp54、またはキメラタンパク質p54/30の組み合わせは、ASFV攻撃後の重篤な疾患から動物を保護した[17、18]。 組換えCD2vによるブタの免疫化は防御抗体の産生を誘導し、2/3の動物をASFV攻撃から防御した[19]。 より最近では、pEP153R が同種 ASFV 感染に対する防御に重要であることが実証されました [20]。 興味深いことに、組換えp30、p72、p54、およびp22の組み合わせで免疫したブタは中和抗体を産生しましたが、攻撃後の疾患の発症の遅延のみを示しました[21]。 細胞性免疫応答も ASFV 感染に対する防御に重要な役割を果たしているという証拠が増えています [22、23]。 ASFV DNA発現ライブラリーによる免疫化により、抗原特異的CD8+ T細胞によるASFV攻撃から60%のブタが防御され[22]、潜在的な防御抗原の存在が明らかになった。 現在のサブユニット ワクチンのアプローチを総合すると、適切な ASFV 抗原の選択と防御体液性免疫および細胞性免疫の強化の重要性が示唆されています。

緑膿菌の主要外膜リポタンパク質 I (OprI) は、Toll 様受容体 (TLR)-2 のリガンドです [24]。 これは、in vivo で樹状細胞 (DC) が炎症誘発性サイトカインを分泌するように誘発することができ、これにより獲得免疫応答が間接的に調節されます [25]。 OprI は、これと融合すると、ペプチド/タンパク質に対する強力な体液性および細胞傷害性 T 細胞応答を誘発する天然アジュバントとして機能します [26]。 融合タンパク質における OprI の適用は、ASFV の B646L および G1340L によってコードされる抗原に拡張されており、得られたタンパク質は細胞傷害性 T リンパ球を誘導することができました [27、28]。 Th1/Th2 応答の促進を含む、OprI のさまざまな免疫機能は、TLR-2 シグナル伝達の活性化に起因すると考えられています [29]。 OprI 融合体の免疫調節活性はワクチンの開発にも利用されており [30]、最近では、OprI 融合抗原によるマウスの免疫化により、ネオスポラ・カニナムの垂直感染と出生後の死亡率が顕著に阻害されることが示されました [31]。

この研究では、OprI と融合した組換え ASFV 抗原のカクテルによって誘発される体液性および細胞性免疫応答と、ASFV 感染に対するそれらの影響を調査しました。 我々は 3 つの組換え OprI 融合タンパク質を設計し、各タンパク質には OprI の C 末端とユニバーサル CD4+ T 細胞エピトープの N 末端が融合した 2 つの異なる ASFV タンパク質/エピトープが含まれています。 これらの組換えタンパク質の免疫刺激活性は、マウス骨髄由来樹状細胞 (BMDC) を使用して評価されました。 次に、これら 3 つの OprI 融合タンパク質のカクテルによって誘導される体液性および細胞性免疫応答をブタで評価しました。 免疫化されたブタからの免疫血清および末梢血単核球（PBMC）の ASFV 感染に対する効果を in vitro で測定し、ブタでのチャレンジ実験に進む前の予備証拠を提供しました。 私たちは、私たちの研究がASFに対する新しいサブユニットワクチンの開発に貢献すると信じています。

初代豚肺胞マクロファージ (PAM) は、豚呼吸生殖症候群ウイルス、古典的豚コレラウイルス、ASFV、および仮性狂犬病ウイルスに対して陰性だった大型白豚 (10 ～ 20 kg) から収集されました。 PAM は、15% ウシ胎児血清 (FBS、Thermo Fisher Scientific) を含む RPMI-1640 培地 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州) 中で、37 °C、5% CO2 で培養されました。 ASFV 中国/四川省/2019 株 (CN/SC/19) は、蘭州獣医研究所 (LVRI、中国農業科学院、中国) のアフリカ豚コレラ地域研究所から入手しました。 中和アッセイに使用した ASFV CN/SC/19 ストックを PAM で増殖および滴定しました。

融合タンパク質の構築に使用したタンパク質/エピトープのアミノ酸配列を表 1に示します。緑膿菌 OprI のアミノ酸配列は GenBank アクセッション X13748.1 に由来し、すべての ASFV タンパク質/エピトープは ASFV 分離株 China/2018 に由来しました。 /AnhuiXCGQ は GenBank アクセッション MK128995.1 から取得されました。 実験によって検証された、選択されたすべての p72 エピトープは、免疫エピトープ データベース (IEDB [www.iedb.org]) から取得されました。 pE248R、CD2v、およびpEP153Rの細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかを選択して、SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)を使用したタンパク質モチーフ分析後に融合タンパク質を構築した。 図1に示すように、OprI-p30修飾p54-TT、OprI-p72エピトープ-△pE248R-TT、OprI-△CD2v-△pEP153R-TTを含む3つのOprI融合タンパク質が構築され、OPMT、OPETと表示されます。および OCET (「△」は切り捨てを表します)。 並行して、p30修飾p54、p72エピトープ-△pE248Rおよび△CD2v-△pEP153Rを対照として設計し、PM、PEおよびCEと表した。 すべての融合タンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換し、化学合成し（GenScript、中国南京市）、pET30a（+）発現ベクター（Novagen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）の NdeI-XhoI 部位にクローニングしました。 6×ヒスチジンタグを保持しています。 構築された発現プラスミドの完全性と忠実性は、DNA 配列決定によって確認されました。

OPMT、OPET、OCET、PM、PE、および CE として示される 6 つの融合タンパク質の概略図。 OprI、細菌性リポプロテイン I の完全な配列。 p30、p30の完全な配列。 p54-1およびp54-2は、それぞれp54の(Met1-Thr29)および(Ser53-Leu184)を表す。 p72-E1、p72-E2、p72-E3、およびp72-E4は、それぞれ、p72の(Gln364-Pro395)、(Ala518-Lys552)、(Tyr179-Leu210)、および(Leu242-Pro273)を表す。 △pE248R、pE248R (Met1-Lys198); △CD2v、CD2v (Asp17-Tyr206); △pEP153R、pEP153R (Asn49-Lys158); TT-P2、ユニバーサル CD4+ T 細胞エピトープ。 黄色の太い線、リンカー 1 "(GGGGS)3"。 黄色の細線、リンカー2「PG」

各発現プラスミドをコンピテント大腸菌 BL21 (DE3) pLysS 細胞 (Takara、大連、中国) に形質転換し、得られた陽性株を 1 mM イソプロピルチオ-β-ガラクトシドを用いて 600 nm での光学密度 (OD) 0.6 で誘導しました。融合タンパク質の発現用。 OPMT、OPET、および OCET は、以前に記載されているように細菌の外膜から単離されました [32]。 簡単に説明すると、細菌ペレットを 2.5 mg/mL リゾチーム (Genscript) を含む Tris-EDTA 緩衝液 (pH 8.0) に再懸濁し、氷上で 35 分間インキュベートしました。 等量のサルコシル (2%、w/v) を添加した後、混合物を超音波処理し、100,000 × g で 2 時間、4 °C で超遠心分離して、不溶性外膜ペレットを得ました。 クロロホルム/メタノール (2:1、v/v) で処理して余分な脂質を抽出した後、外膜を 6 M 塩酸グアニジンに可溶化し、その後 8 M 尿素の存在下で Ni アフィニティークロマトグラフィーによって精製しました。 対照的に、PM、PE、および CE は、同じクロマトグラフィー プロセスの下で、それらが誘導した細菌の封入体から精製されました。 溶出されたすべての組換え融合タンパク質は透析によって再折り畳みされました。 次いで、Triton X-114を使用した相分離によってエンドトキシンを除去した。 精製タンパク質サンプル中のエンドトキシン レベルは、ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (Genscript) を使用して測定しました。

ほぼ等量の各組換えタンパク質を 12% SDS-PAGE に供しました。 ゲルをクーマシーブルーで染色するか、ポリ二フッ化ビニリデン膜（ミリポア、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）に転写しました。 膜を 5% スキムミルク中で室温 (RT) で 2 時間ブロックし、続いて抗ヒスチジンモノクローナル抗体 (mAb) (1:5000 希釈、Abcam、ケンブリッジ、英国) または抗 ASFV ブタ血清 (1 :300 希釈、中国獣医薬品管理研究所、北京、中国) 4 °C で一晩。 PBS (PBST) 中の 0.05% Tween-20 で 5 回洗浄した後、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合ヤギ抗マウス IgG (1:5000 希釈、Abcam) または HRP 結合ヤギ抗ブタ IgG とともにインキュベートしました。 (1:5000 希釈、Abcam) 室温で 1 時間。 PBSTで洗浄した後、増強された化学発光試薬(Thermo Fisher Scientific)を用いてブロットを発色させた。

すべての組換え融合タンパク質の DC 刺激を評価しました。 BMDC は前述のように生成されました [33]。 BMDC を収集し、5 × 105 細胞/mL の密度に調整し、各タンパク質 (1 または 5 μg/ml)、リポ多糖 (LPS、0.1 μg/ml) または培地の存在下でさらに 24 時間培養しました。 腫瘍壊死因子-α (TNF-α) およびインターロイキン-12p70 (IL-12p70) は、市販の ELISA キット (Neobioscience、深セン、中国) によって培養上清中で測定されました。

2 つの抗原グループ。1 つは OPMT (150 μg/mL)、OPET (150 μg/mL)、OCET (300 μg/mL) で構成され、もう 1 つは PM (150 μg/mL)、PE (150 μg/mL) で構成されます。およびＣＥ（３００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ等量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６（ＩＳＡ２０６、ＳＥＰＰＩＣ Ｉｎｃ．、パリ、​​フランス）で乳化し、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）ブレンドを形成した、すなわち、O-Ags-T 製剤 (OPMT + OPET + OCET + ISA206) および Ags 製剤 (PM + PE + CE + ISA206) です。 合計 11 頭の生後 6 週間の健康な異系交配豚を地元の農場から入手し、LVRI の大型動物研究センターで集団飼育しました。 動物管理プロトコルは、LVRI の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 すべてのブタをランダムに 3 つのグループに分け（グループ 1 とグループ 2 は n = 4、対照グループは n = 3）、3 週間間隔で筋肉内経路で 2 回免疫化しました。 グループ１およびグループ２の動物を、それぞれＯ－Ａｇｓ－Ｔ製剤およびＡｇｓ製剤（２ｍＬ／ブタ）で免疫した。 対照ブタには、ISA206を配合した等量のPBSを与えた。 ワクチン接種後 (dpv) 0、14、21、35、および 42 日目にすべてのブタから​​採血しました。

ワクチン接種したブタの血清中の抗原特異的 IgG 応答を間接 ELISA によって測定しました。 簡単に説明すると、96 マイクロウェル プレート (Costar、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国) を組換え p30 (0.125 μg/mL)、修飾 p54 (0.5 μg/mL)、p72 (1 μg/mL)、△ pE248R (1 μg/mL)、△CD2v (2 μg/mL)、および△pEP153R (2 μg/mL) を 4 °C で一晩反応させ、5% スキムミルクで 37 °C で 2 時間ブロックしました。 免疫化したブタからの血清サンプル (1:100 希釈) を各ウェルに加え、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 並行して、ブランク対照および陰性対照を設定した。 PBSTで5回洗浄した後、プレートを抗ブタIgG-HRP（1:10,000希釈）とともに37℃で1時間インキュベートしました。 一連の最終洗浄の後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質を用いて 37 °C で 15 分間発色させ、2 M H2SO4 で発色を止めました。 各ウェルの 450 nm での OD (OD450) を、マイクロプレート リーダー (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定しました。

末梢血サンプルを各免疫化ブタから４２ｄｐｖでヘパリンナトリウムバキュテナーチューブに採取した。 PBMC は、リンパ球分離溶液 (Dakewei、深セン、中国) を使用してヘパリン添加血液から分離され、細胞増殖の検出のために 5(6)-カルボキシフルオレセイン ジアセテート スクシンイミジル エステル (CFSE、Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) で染色されました。 簡単に説明すると、合計 2 × 106 PBMC を 1 mL の CFSE 標識溶液 (1.25 μM) とともに 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 PBS で 3 回洗浄した後、細胞を 5% FBS を含む RPMI-1640 に 1 × 106 細胞/mL で再懸濁し、24 ウェル プレート (1 × 106 細胞/ウェル、Corning、NY、USA) で培養しました。熱不活化ASFV（105±50％血液吸着用量（HAD50））を72時間投与。 並行して、コンカナバリン A (5 μg/mL、Dakewei) または培地で処理した未染色細胞および染色細胞を、それぞれブランク、陽性および陰性対照として確立しました。 フローサイトメトリーによる増殖分析のために細胞を収集したが、これはCFSE蛍光強度の低下(CFSE-low)によって示された。

PBMC を上記のように取得し、24 ウェル プレートに播種しました (1 × 106 細胞 1 mL/ウェル)。 不活化ASFV（105 HAD50）を各ウェルに添加した後、細胞を40時間培養し、モネンシン（1.7μg/mL、Biolegend、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）とともにさらに8時間インキュベートしました。 並行して、細胞活性化カクテル (1:1000 希釈、Biolegend) または培地とともにインキュベートした PBMC をポジティブおよびネガティブコントロールとして確立しました。 各ウェルの細胞を収集し、PerCP/シアニン色素 5.5 結合抗 CD3、フルオレセイン イソチオシアネート結合抗 CD4 およびフィコエリトリン結合抗 CD8α mAb (すべて BD Biosciences、サンディエゴ、米国) で 30 分間染色しました。 4℃で。 Fix 試薬および Perm 試薬 (BD Biosciences) で処理した後、細胞を Alexa Fluor 647 (AF647) 結合抗 IFN-γ mAb (BD Biosciences) で 30 分間染色しました。 細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリー分析に供した。 細胞をゲートして CD3+ T リンパ球を選択し、その中で CD4+ および CD8+ T 細胞のゲートをさらに決定しました。 IFN-γ 産生 (IFN-γ+) CD4+ および CD8+ T 細胞の割合をサンプルごとに分析しました。

0 dpv (免疫前血清) および 42 dpv (免疫血清) で収集した各グループの血清の中和活性を、以前に記載されているように評価しました [34]。 ASFV CN/SC/19 (感染多重度 (MOI) = 0.01、接種用 PAM によって計算) を 200 μL の熱不活化血清 (希釈: 1/5) または等量の培地 (陰性対照) と混合し、インキュベートしました。 37℃で一晩。 血清/ASFV混合物を24ウェルプレート内のPAM単層上に接種した。 37℃で1時間ウイルスを吸着した後、ウイルス接種材料を除去し、5％FBSを含むRPMI-1640を添加し（500μL/ウェル）、さらに48時間インキュベートした。 各サンプルには 3 つの複製が含まれていました。 各サンプルの ASFV ゲノム コピー数は、ASFV 用の定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) キット (診断製品センター、LVRI) によって決定されました。 各血清サンプルの中和率は次のように計算されました。

中和 (%) = 100 – 100 × 免疫血清存在下での ASFV のコピー数 / 免疫前血清存在下での ASFV のコピー数。

42 dpv での免疫血清の中和活性も間接免疫蛍光分析によって評価しました。 血清をASFVとともにインキュベートし、上記のようにPAM単層上に接種した。 48 時間インキュベートした後、細胞を PBS で洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで 4 °C で 1 時間固定しました。 0.25% Triton X-100 で 10 分間透過処理した後、細胞を 5% BSA で 1 時間ブロックし、さらに抗 p30 mAb (1:300 希釈、我々の研究室で製造) とともに 1 時間インキュベートしました。 PBSで洗浄した後、細胞をテトラエチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）結合ヤギ抗マウスIgG（1：500希釈、Abcam）とともに1時間インキュベートし、続いてDAPI（Thermo Fisher Scientific）で5分間染色した。 PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡(Leica、Wetzlar、ドイツ)を用いて画像記録を行った。

42 dpv で免疫化したブタから PBMC を上記のように取得し、24 ウェル プレート (500 μL/ウェル) で 1 × 106 細胞/mL で培養し、ASFV CN/SC/19 (MOI = 0.01) で 48 時間感染させました。 37℃。 等量のASFVを接種した非免疫化健康ブタからのPBMCは対照として機能する。 各サンプルについて、3 回の反復を実施しました。 各サンプル中の ASFV ゲノム コピー数は、ASFV の qPCR キットによって決定され、免疫化されていないブタからの PBMC に出現したコピー数と比較されました。 PBMC の各グループの ASFV 感染の阻害率は次のように計算されました。

阻害 (%) = 100 – 100 × 免疫化されたブタの PBMC 内の ASFV のコピー数 / 免疫化されていないブタの PBMC 内の ASFV のコピー数。

すべての実験は 3 回繰り返され、一貫した結果が得られました。 図の凡例に示されているように、図内のデータは平均 ± 標準偏差 (SD) として表されます。 グループ間の差異の統計的有意性は、一元配置分散分析およびスチューデントの t 検定 (GraphPad Prism ソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) によって決定されました。 P > 0.05では、グループ間の有意性(NS)は確立されませんでした。 * P < 0.05、** P < 0.01、および *** P < 0.001 は、グループ間の統計的に有意な差であると考えられました。

各融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターは正常に構築され、タンパク質発現のために大腸菌に形質転換されました。 これらの His タグ付き組換えタンパク質は、Ni アフィニティー クロマトグラフィーによって精製され、SDS-PAGE によって検証されました (図 2A)。 クーマシーブルーで染色した後、OPMT、OPET、OCET、PM、PE、および CE に対応するバンドがはっきりと見えました。 精製された組換えタンパク質は、抗ヒスチジン mAb (図 2B) および抗 ASFV ブタ血清 (図 2C) を使用したウェスタンブロットによっても確認されました。 エンドトキシン除去後、精製組換えタンパク質中のエンドトキシン濃度はカブトガニ変形細胞ライセートアッセイによって検出され、0.1 EU/μg 未満であることが示されました。

SDS-PAGE およびウェスタンブロッティングによる精製組換え融合タンパク質の同定。 精製された組換えタンパク質の SDS-PAGE 分析。 レーン M、分子量マーカー。 レーン 1、OPMT; レーン 2、OPET。 レーン 3、OCET。 レーン 4、午後。 レーン 5、PE。 レーン6、CE。 一次抗体として抗ポリヒスチジン mAb (B) または抗 ASFV 豚血清 (C) を使用し、対応する二次抗体を使用した精製組換えタンパク質のウエスタンブロットによる確認。 レーンの内容はパネル (A) と同じです

組換えタンパク質の免疫刺激活性を BMDC で評価しました。 1 μg/mL または 5 μg/mL の OPMT、OPET、および OCET とインキュベートした BMDC の培養上清中の TNF-α (図 3A) および IL-12p70 (図 3B) のレベルは、PM のレベルよりも有意に高かった、PEおよびCE。 すべての組換えタンパク質の中で、OPMT はいずれの濃度でも最高レベルの TNF-α および IL-12p70 を誘導しました。 これらの結果は、OprI融合タンパク質がDCの強力かつ特異的な刺激を誘導できることを示唆しています。

刺激後に DC によって分泌されるサイトカイン。 各組換えタンパク質 (1 または 5 μg/mL)、LPS (0.1 μg/mL)、または培地 (コントロール) で 24 時間 BMDC を刺激した後の培養上清中の TNF-α (A) および IL-12p70 (B) レベル。 すべてのデータは平均値 ± SD (n = 3) として表示されます。 NS = P > 0.05; *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001

免疫化されたブタにおける IgG 応答は、間接 ELISA によって測定されました。 図 4A ～ E に示すように、O-Ags-T 製剤を投与したブタの血清では、p30、p54、p72、pE248R、CD2v、および pEP153R 特異的 IgG のレベルが 14 dpv で検出可能でした。またはAgs製剤を使用し、追加ワクチン接種後（35および42dpvで）より高いレベルに増加しました。 対照的に、6 種類すべての抗原特異的 IgG は、0 dpv のすべてのブタの血清およびどの時点でも PBS で免疫したブタの血清ではほとんど検出されませんでした。 Ags製剤を投与されたブタと比較して、O-Ags-T製剤で免疫化されたブタは、同程度のレベルのp30特異的IgGおよびp54特異的IgGを産生し、同じ時点でそれらの間に有意差はなかった(P>0.05)。 しかし、O-Ags-T製剤によるブタの免疫化は、Ags製剤による免疫化と比較して、35および42dpvで有意に高いレベルのp72、pE248R、CD2vおよびpEP153R特異的IgGを誘導した。 総合すると、データは、ISA206と配合されたOprI融合タンパク質のカクテルによる免疫化が、ブタにおいてASFV抗原特異的IgG応答を効率的に誘発したことを示している。

抗原特異的 IgG の検出。 0、14、21、35、および 42 dpv での各免疫ブタの血清中の p30 (A)、p54 (B)、p72 (C)、pE248R (D)、CD2v (E) および pEP153R (F) に対する IgG 応答血清希釈 1:100 およびヤギ抗ブタ IgG-HRP 希釈 1:10,000 を使用した間接 ELISA によって検出されました。 結果はOD450 (平均±SD)として表されます。 NS = P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001

免疫化されたブタにおける細胞性免疫応答を測定するために、42 dpv での各ブタの PBMC におけるリンパ球の増殖を CFSE 標識によって評価しました。 図５Ａに示すように、Ｏ−Ａｇｓ−Ｔ製剤を投与されたブタは、不活化ＡＳＦＶで刺激された場合、３つの群の中で最も高い割合のＣＦＳＥ−低リンパ球を示し、これはリンパ球の最も高い増殖を示した。 Ags 製剤で免疫したブタは、刺激後にリンパ球の穏やかな増殖を示しました。 対照的に、PBS で免疫したブタからの PBMC ではリンパ球の増殖は検出されませんでした。 増殖リンパ球の割合は、3 つの独立した実験で決定されました (図 5B)。 O-Ags-T 製剤によるブタの免疫化は、Ags 製剤または PBS による免疫化よりも有意に高い割合のリンパ球増殖を誘導しました (P < 0.001)。

不活化ASFVによるインビトロ刺激後の免疫化ブタ由来のPBMCにおけるリンパ球の増殖。 A CFSEで染色し、不活化ASFV、培地（陰性対照）またはコンカナバリンA（陽性対照）とインキュベートした後、42 dpvで免疫化ブタからのPBMCにおいてフローサイトメトリーによって検出されたCFSE低リンパ球（P2で表す）の割合。 グループ１およびグループ２はそれぞれ、Ｏ－Ａｇｓ－Ｔ製剤またはＡｇｓ製剤で免疫化されたブタを表す。 B 3 つの別々の実験からの PBMC 内の CFSE 低リンパ球に基づいて計算された増殖リンパ球のパーセンテージ。 グラフは平均結果を示し、誤差バーは SD を示します。 **P < 0.01; ***P < 0.001

反応性リンパ球の種類をさらに調査するために、42 dpv での免疫化ブタからの PBMC における IFN-γ+ CD4+ および CD8+ T 細胞の割合をフローサイトメトリーによって測定しました。 CD3+、CD4+、およびCD8+ T細胞を1つずつゲートしました（追加ファイル1：図S1）。 不活化ASFVによる刺激後、O-Ags-T製剤で免疫したすべてのブタのPBMCは、高い割合のIFN-γ+ CD4+およびIFN-γ+ CD8+ T細胞を示しました（追加ファイル2および3：図S2およびS3）。 各グループにおける IFN-γ+ CD4+ および IFN-γ+ CD8+ T 細胞の割合は、3 つの独立した実験で決定されました (図 6A および B)。 O-Ags-T 製剤を投与されたブタからの IFN-γ+ CD4+ および IFN-γ+ CD8+ T 細胞の割合は他のグループよりも有意に高く、強力な T 細胞媒介免疫応答を示しました。 O-Ags-T 製剤を投与されたブタからの IFN-γ+ CD8+ T 細胞の平均パーセンテージは、IFN-γ+ CD4+ T 細胞の平均パーセンテージよりも約 2 倍高く、ASFV 特異的 CD8+ T 細胞応答がより強いことを示しています。 これらのデータは、OprI融合タンパク質カクテルによるブタの免疫化が強力なASFV特異的細胞免疫応答を誘発し、これがASFV感染に対する防御に寄与する可能性があることを実証している。

42 dpv での免疫化ブタからの PBMC 内の IFN-γ 産生 T 細胞。 不活化ASFV、培地（陰性対照）または細胞によるインビトロ刺激後の42dpvでの免疫化ブタ由来のPBMCにおけるIFN-γ分泌CD4+ T細胞（A）およびIFN-γ分泌CD8+ T細胞（B）の割合活性化カクテル（ポジティブコントロール）。 グラフは平均結果を示し、誤差バーは SD を示します。 NS = P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001

免疫血清の ASFV 中和活性を分析するために、PAM 単層における ASFV の増殖に対するその効果を測定しました。 最初のアプローチでは、各サンプルの ASFV ゲノムのコピー数が qPCR によって決定されました。 図７Ａに示すように、対照群と比較して、Ｏ−Ａｇｓ−Ｔ製剤またはＡｇｓ製剤のいずれかで免疫したブタからの血清は、ＡＳＦＶゲノムコピー数を有意に減少させ（Ｐ＜０．００１）、これはＰＡＭにおけるＡＳＦＶ増殖の阻害を示す。 対照的に、PBSで免疫化したブタおよび免疫化前のすべてのブタから​​の血清は、ASFVゲノムのコピー数を減少させる能力を示さなかった。 結果に基づいて、O-Ags-T製剤またはAgs製剤で免疫したブタからの血清によって中和されたASFVの割合を計算した。 O-Ags-T製剤またはAgs製剤を投与されたブタからの血清によって中和されたウイルスの平均パーセンテージは、それぞれ81.6%および82.8%であり、それらの間に有意差はなかった(P>0.05)(図7B)。

42dpvでの免疫化ブタからの血清によるASFV感染の中和。 A 熱不活化した免疫前血清、免疫血清（両方とも 1:5 希釈）または等量の培地（陰性対照）とそれぞれプレインキュベートした、ASFV に感染した PAM における ASFV ゲノムのコピー数（MOI = 0.01）。 B 42 dpv で O-Ags-T 製剤または Ags 製剤で免疫したブタからの血清による ASFV 中和のパーセンテージ。 平均結果と標準誤差が表示されます。 NS = P > 0.05; ***P < 0.001

免疫血清の ASFV 中和活性も、間接免疫蛍光法による PAM 中の ASFV の存在の減少から決定されました。 血清をインキュベートしない ASFV (陰性対照) とは対照的に、O-Ags-T 製剤または Ags 製剤で免疫したブタからの血清と ASFV をインキュベートすると、感染後の TRITC 強度と TRITC 陽性細胞の数が顕著に減少することが示されました (図 1)。 8)。 対照的に、PBS 免疫血清とプレインキュベートした ASFV に感染した PAM には目に見える変化はありませんでした。 これらの結果は、ブタにおいてO-Ags-T製剤またはAgs製剤によって誘導された抗体が、インビトロでASFV感染力を中和できることを確認した。

ASFV に感染した PAM の間接的な免疫蛍光による同定。 グループ 1 (O-Ags-T 製剤)、グループ 2 (Ags 製剤)、および PBS グループまたは培地 (陰性対照) からの熱不活化免疫血清 (42 dpv) とプレインキュベートした ASFV に感染した PAM (MOI = 0.01) を、間接免疫蛍光アッセイ。一次抗体として抗 p30 mAb、二次抗体としてヤギ抗マウス IgG-TRITC を使用します。 DAPI は核の染色を示します。 下のパネルは、上の 2 つのチャネルのマ​​ージを表します。

42dpvで免疫化ブタから単離したPBMCをASFVに感染させ、ASFV感染に対するそれらの影響を調べた。 非免疫化ブタまたはＰＢＳ免疫化ブタからのＰＢＭＣは両方とも、感染後により高いＡＳＦＶゲノムコピー数を示し、それらの間に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（図９Ａ）。 非免疫化ブタ由来のＰＢＭＣとは対照的に、Ｏ－Ａｇｓ－Ｔ製剤またはＡｇｓ製剤で免疫化されたブタ由来のＰＢＭＣでは、ＡＳＦＶゲノムのコピー数が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、インビトロでのＡＳＦＶ感染に対するそれらの阻害効果が示された。 上記の結果に基づいて、これら２つのグループからのＰＢＭＣにおけるＡＳＦＶ感染の阻害率を計算し、図９Ｂに示した。 O-Ags-T 製剤で免疫したブタの PBMC は、in vitro で ASFV 感染を 92.6% も阻害しました。これは、Ags 製剤で免疫したブタよりも有意に高かったです (p < 0.001)。 これは、OprI融合タンパク質カクテルによるブタの免疫化後の細胞性免疫応答の抗ウイルス効果の増強を示唆している。

42dpvでの免疫化ブタからのPBMCにおけるASFV感染の阻害。 非免疫化ブタ、またはASFVに感染した42 dpvでの免疫化ブタからのPBMCにおけるASFVゲノムのコピー数(MOI = 0.01)。 B O-Ags-T製剤またはAgs製剤で42dpvで免疫したブタからのPBMCにおけるASFV阻害率。 平均結果と標準誤差が表示されます。 NS = P > 0.05; ***P < 0.001

ASF に対する安全で効果的なワクチンの開発は、ウイルスの複雑な性質により非常に困難です [8]。 ASFワクチンを開発するアプローチの中で、標的遺伝子欠失によって生成された弱毒生ASFV株は、ASFV攻撃に対する強力な防御免疫を誘導するため非常に有望であるように思われるが、このアプローチは依然として病原性への逆戻りのリスクに悩まされている[35]。 。 対照的に、ASFV に対するサブユニットベースのワクチンは、これらの潜在的な問題を回避し、弱毒化 ASFV よりも製造が容易であると思われます [36]。 ASFに対するさまざまな種類のサブユニットベースのワクチンが、ASFVに感染したブタで評価されており、その一部はある程度の防御を与えたが[17、18、19、36]、そのうちのいくつかは、ASFVが増加したにもかかわらず防御を提供しなかった。抗原はワクチンに含まれていた[21、37]。 これらの結果は、ASFに対するサブユニットワクチンの開発において、適切なASFV抗原の選択と防御体液性免疫および細胞性免疫の強化の重要性を強調している。

本研究では、p30、p54、p72、pE248R、CD2vおよびpEP153Rに基づく3つの組換え融合タンパク質を構築し、ASFに対するカクテルワクチンを調製するために使用した。 選択された ASFV タンパク質の中で、p30、p54、p72、および CD2v はサブユニット ワクチンで広く研究されており、ASFV に対する防御免疫応答または中和抗体を誘導することが示されています。 他の 2 つの ASFV タンパク質、pE248R および pEP153R は、遺伝子ノックアウト実験で潜在的な防御抗原であることが実証されました [20、38]。 大腸菌における膜タンパク質および100 kDaを超えるタンパク質の発現は困難であるため[39]、SMARTによるタンパク質モチーフ分析に従って、膜タンパク質のすべてのアミノ酸配列（p54、pE248R、CD2v、pEP153R）が修飾または短縮されました。そして、同定されたp72エピトープは、p72の完全な配列の代わりに使用されました。 ASFV タンパク質によって誘導される体液性および細胞性免疫応答を強化するために、OprI および破傷風トキソイド (TT-P2) のユニバーサル CD4+ T 細胞エピトープ P2 (aa 830-844) を含めて各組換え融合タンパク質を構築しました。 一方で、TLR-2を標的とするOprIは、単球/マクロファージによって効率的に取り込まれ、抗原特異的免疫応答を改善することができる[26]。 一方、TT-P2 は、マラリア用のペプチドワクチン [40] およびロタウイルス用のエピトープベースのワクチン [41] の免疫原性を高めることが示されています。 私たちの研究の主な目的は、ASFV タンパク質によって誘導される免疫応答を強化し、3 つの OprI 融合タンパク質のカクテルのワクチンの可能性をさらに評価することです。

DC は免疫系の専門的な番兵であり、免疫応答の誘導に不可欠であるため [42]、マウス BMDC を使用して組換えタンパク質の刺激活性を評価しました。 ＯｐｒＩ融合タンパク質は、より高いレベルのＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ７０を分泌することによって実証されるように、ＤＣを活性化することができた。 OPMT および OPET によって誘導される TNF-α のレベルは、以前の研究 [31] の OprI 融合タンパク質と同様でしたが、OCET によって誘導された TNF-α のレベルは比較的低かったです。 この理由として最も考えられるのは、CD2v または pEP153R に阻害モチーフが存在することです。 この推論は、pEP153R が MHC クラス I の発現を減少させることが判明した最近の研究によって確認されました [43]。 OprI融合タンパク質によって引き起こされるDCの成熟と活性化は、TLR2/4シグナル伝達経路の活性化に起因すると考えられている[25]。 これらの結果は、OprI融合タンパク質がDCを活性化することができ、T細胞媒介免疫応答の活性化に寄与している可能性があることを示唆している。

ELISA からのデータは、O-Ags-T 製剤または Ags 製剤による免疫化がブタにおいてさまざまなレベルの IgG 応答を誘導することを示しました。 どちらの製剤もブタの p30 および p54 に対して同様に高レベルの IgG を誘導したため、OprI および TT-P2 の p30 および p54 への融合は融合タンパク質の免疫原性にほとんど影響を及ぼさないと推測されました。 これは、p30 と p54 が本質的に免疫原性が高いためであると考えられます [44]。 対照的に、OprIおよびTT-P2を含めると、p72エピトープと△pE248R、および△CD2vと△pEP153Rの融合タンパク質の免疫原性が大幅に増強された（図4C～E）。 この発見は、TT-P2と組み合わせたOprI融合戦略が、免疫原性の低いASFVタンパク質からなる融合タンパク質の免疫原性をよりよく増強できることを示唆している。 我々の結果は、ISA206と配合されたOprI融合タンパク質のカクテルによって強力な体液性免疫応答が誘発されることを示しており、ウイルスタンパク質に融合したときのOprIとTT-P2の機能についての理解が深まりました。

細胞性免疫応答が ASFV による細胞内感染に対する防御免疫に大きく寄与していることが示されているため [22、45、46、47]、我々は in vitro 刺激後の PBMC におけるリンパ球の増殖を測定しました。 O-Ags-T製剤で免疫したブタは、Ags製剤で免疫したブタよりも有意に高いレベルのリンパ球増殖を生成し、OprIおよびTT-P2をASFVのタンパク質/エピトープに融合させると、ASFVに対する細胞性免疫応答が顕著に増強されたことが示された。 さらに、機能的な T リンパ球を表す IFN-γ+ CD4+ および IFN-γ+ CD8+ T 細胞も本研究で測定されました。 リンパ球の増殖に従って、O-Ags-T製剤で免疫したブタにおけるIFN-γ+ CD4+およびIFN-γ+ CD8+ T細胞の割合は、Ags製剤またはPBSで免疫したブタよりも有意に高かった。 CD4+ および CD8+ T 細胞によって分泌される IFN-γ は、免疫応答の Th1 型への極化に寄与し、IFN-γ+ CD8+ T 細胞は細胞溶解活性を発揮することができます [48]。 これらの結果は、OprI融合タンパク質カクテルによる免疫化がASFV特異的T細胞の活性化を促進し、ASFV感染に対する防御に寄与する可能性があることを示唆している。

O-Ags-T 製剤でワクチン接種したブタの血清ではより高レベルの抗原特異的 IgG が検出されましたが、免疫血清がウイルスを中和できるかどうかは不明のままでした。 したがって、免疫血清の ASFV 中和能力を分析するために、in vitro で中和アッセイを実施しました。 O-Ags-T 製剤または Ags 製剤で免疫したブタの血清は、in vitro で ASFV の 80% 以上を中和しました。 以前の研究では、バキュロウイルスで発現した組換えp30で免疫したブタの血清は、ASFVの約90％を中和し、これは我々の研究のものよりも高かった[49]。 この不一致の最も可能性の高い理由は、より多量のウイルス接種または我々の研究で使用された異なるタンパク質発現システムである可能性があります。 対照的に、同じ研究では、p54 または p72 で免疫化されたブタからの血清の ASFV 中和率は比較的低かった。 より最近では、ASFV 組換えタンパク質と ASFV 遺伝子を発現する pcDNA の組み合わせを投与されたブタの血清は、中和試験で使用されたアッセイが異なるにもかかわらず、我々の血清と同様の ASFV 中和率を示しました [50]。 興味深いことに、O-Ags-T製剤で免疫したブタは、Ags製剤で免疫したブタよりもp72、pE248R、CD2vおよびpEP153Rに対して有意に高いレベルのIgGを産生しましたが、ウイルスは、いずれかの投与を受けたブタの血清によって同様によく中和されました。彼ら。 これは、p30 および p54 特異的 IgG が ASFV の中和において主要な役割を果たしており、2 つのグループ間に有意差がないためであると考えられます (図 4A および 4B)。 また、図 7 に示すように、ASFV がいずれの製剤で免疫したブタの血清によっても完全には中和されないこともわかりました。同様の観察が以前の研究でも報告されています [51、52]。これはおそらく ASFV の複雑な性質によるものと考えられます。

ASFV感染に対する細胞性免疫の影響を調査するために、免疫化されたブタからのPBMCにおけるウイルスの繁殖を測定した。 増殖リンパ球およびIFN-γ+ CD8+ T細胞のパーセンテージに従って、O-Ags-T製剤またはAgs製剤で免疫化されたブタからのPBMCは、対照群のPBMCと比較して、インビトロでASFV感染を有意に阻害することが示された。 同様の観察が以前の研究でも報告されており、弱毒生サル免疫不全ウイルス（SIV）をワクチン接種されたマカクザルのPBMCは、未治療の対照のPBMCよりも毒性SIVのin vitro感染に対する感受性が有意に低かった[53]。 PBMC のウイルス阻害効果は、ウイルス特異的な CD8+ T リンパ球に起因すると考えられています [54]。 これと一致して、O-Ags-T製剤で免疫したブタからのPBMCは、有意に高い割合のIFN-γ+ CD8+ T細胞を示し、Ags製剤で免疫したブタからのPBMCよりもほぼ2倍高い割合でインビトロでASFV感染を阻害した。 これらのデータは、OprI融合タンパク質のカクテルによる免疫化によって活性化されたTリンパ球が、インビトロでASFV感染をよりよく阻害でき、ASFV攻撃に対する効果的な防御細胞免疫応答につながる可能性があることを示唆している。

本研究は、OPMT の OprI と TT-P2 がマウスの p30 および p54 特異的免疫応答の増強に寄与し、OPMT によって誘導された抗体が in vitro で ASFV に対して一定の中和活性を示したことを実証した以前の研究の延長として行われました。 55]。 その結果、OprIおよびTT-P2を使用してOPETおよびOCETを構築し、抗ASFV免疫応答を誘導することが示されたp72エピトープ、pE248R、CD2vおよびpEP153Rの免疫原性を改善した[56]。 さらに、本研究では、ブタにおけるOPMT、OPET、およびOCETのカクテルによって誘導される体液性および細胞性免疫応答、ならびに免疫血清およびPBMCのASFV阻害効果が評価されました。 この研究の発見は、O-Ags-T 製剤を用いた ASFV 攻撃実験の基礎を提供します。

要約すると、我々の研究は、ISA206アジュバントを配合した、細菌性リポタンパク質OprIとユニバーサルCD4+ T細胞エピトープを融合した2つの異なるASFVタンパク質/エピトープをそれぞれ含む3つの組換えOprI融合タンパク質のカクテルによる免疫化が、強力なASFV特異的体液性誘導を引き起こすことを実証している。ブタの細胞性免疫反応。 さらに重要なことは、免疫したブタの血清とPBMCがそれぞれin vitroでのASFV感染を82.8%と92.6%阻害したことである。これはおそらくASFV攻撃に対する効率的な防御免疫と相関している。 さらなる研究は、ブタにおける致死性のASFV攻撃に対するワクチン候補としてのO-Ags-T製剤の防御効果を評価することを目的とすべきであり、ASFVに対する防御免疫応答におけるさまざまなASFVタンパク質の役割を調査することは非常に興味深いであろう。 全体として、私たちの研究は、ASFに対する将来のサブユニットワクチンの開発に貴重な情報を提供します。

この研究で使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から取得および利用可能です。

アフリカ豚コレラ

アフリカ豚コレラウイルス

主要な外膜リポタンパク質 I

トール様受容体

差別化のクラスター

骨髄由来樹状細胞

末梢血単核球

ブタ肺胞マクロファージ

ウシ胎児血清

蘭州獣医研究所

普遍的な破傷風トキソイド CD4+ T 細胞エピトープ P2

切断型 CD2v 切断型 pEP153R

p72 エピトープ切断型 pE248R

p30 修飾 p54

OprI 切断型 CD2v 切断型 pEP153R-TT

OprI-p72 エピトープ切断型 pE248R-TT

OprI-p30 修飾 p54-TT

光学密度

エチレンジアミン四酢酸

カブトガニ変形細胞ライセート

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動

室温

モノクローナル抗体

リン酸緩衝生理食塩水

0.05% Tween-20 を含む PBS

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

リポ多糖類

腫瘍壊死因子-α

インターロイキン-12p70

インターフェロン-γ

OPMT、OPET、OCETのカクテル

酵素免疫測定法

ワクチン接種後の日数

免疫グロブリンG

5(6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル

50% 血液吸収用量

アレクサフルオール647

定量的ポリメラーゼ連鎖反応

ローダミンイソチオシアン酸テトラエチル

感染の多重度

標準偏差

意味なし

主要組織適合性複合体

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エンドトキシン検出の支援については Aixiu Wang、フローサイトメトリー分析の支援については Lingxia Li および Ruoqing Mao に感謝します。

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2021YFD1800034）からの助成金によって支援されました。

OIE/中国国家口蹄疫参考研究所、中国農業科学院蘭州獣医研究所、中国甘粛省蘭州市

Guangrei Zhang、Wei Liu、Sicheng Yang、Yuuny Ma、Guangqing Zhou、Xiaxia Liang、Chun Miao、Junhui Liu、Yanhong Liu、Junjun Shao、Huiyun Chang

広東省農業科学院動物衛生研究所、広州、中国

シュアイソング

Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd. (LIBP)、China National Biotec Group Company Limited (CNBG) の子会社、Lanzhou, Lanzhou, 730046, China

張広雷

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GZ、HC、JS が実験を考案しました。 GZ、WL、SY、YM が実験を実行しました。 GZ、XL、CM、JL、YL がデータを分析しました。 HC、JS、SS は試薬/材料/分析ツールを提供しました。 GZとHCが原稿を書きました。 著者全員が原稿を読んで承認しました。

Junjun Shao または Huiyun Chang への通信。

ASFV に関するすべての実験は、中国農業科学院 (CAAS) の蘭州獣医研究所 (LVRI) にあるバイオセーフティ レベル 3 の施設内で実施されました。 動物実験は、中華人民共和国国家科学技術委員会およびCAASのLVRI動物福祉安全委員会によって承認された実験動物に関する事務の管理に関する規則（No. LVRIAEC2018-008）。 この研究で使用されたすべての動物は、実験中に人道的に採血され、研究終了時に安楽死させられました。

著者全員が原稿を出版することに同意しました。

著者は利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

：図S1。 42 dpv での免疫化ブタの PBMC における IFN-γ 産生 T 細胞の検出におけるゲーティング戦略。

：図S2。 不活化ASFV、培地、または細胞活性化カクテルによるインビトロ刺激後の42 dpvにおける各免疫化ブタからのPBMCにおけるIFN-γ産生CD4+ T細胞(P8で表す)のパーセンテージ。 グループ１およびグループ２はそれぞれ、Ｏ－Ａｇｓ－Ｔ製剤またはＡｇｓ製剤で免疫化されたブタを表す。

：図S3。 不活化ASFV、培地、または細胞活性化カクテルによるインビトロ刺激後の42 dpvにおける各免疫化ブタからのPBMCにおけるIFN-γ産生CD8+ T細胞(P5で表す)のパーセンテージ。 グループ１およびグループ２はそれぞれ、Ｏ－Ａｇｓ－Ｔ製剤またはＡｇｓ製剤で免疫化されたブタを表す。

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転載と許可

Zhang、G.、Liu、W.、Yang、S. 他。 家畜豚において、OprIと融合した組換えアフリカ豚コレラウイルス抗原のカクテルによって誘発される体液性および細胞性免疫応答の評価。 Virol J 20、104 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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受信日: 2022 年 12 月 20 日

受理日: 2023 年 5 月 14 日

公開日: 2023 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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